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Obtenção da metacaspase recombinante de Leishmania major
(Universidade de Mogi das Cruzes, 2025-02-28) COSTA, João Pedro Martins Silva; MARCONDES, Maurício Ferreira Marcondes
A Leishmania major é um protozoário parasita de elevada relevância clínica, sendo um grande problema de saúde pública. Devido a vários mecanismos de patogenicidade, fatores de virulência e aos mecanismos de resistência da L. major, além dos tratamentos atuais apresentarem limitações e potenciais efeitos adversos, é necessária a busca de novos alvos terapêuticos e novos tratamentos para infecções causadas por este agente infeccioso. A L. major apresenta uma única metacaspase (LmMCA-Ia), enzima envolvida na regulação de diversos mecanismos celulares e principalmente no processo de morte celular programada. Neste trabalho, buscamos clonar, expressar e purificar a LmMCA-Ia. No entanto, diversas tentativas de expressão da forma íntegra da proteína não resultaram na detecção da enzima. Como alternativa, foi produzida uma forma truncada da enzima, com deleção da região C terminal hidrofóbica (LmMCA-Ia-C-term), visando minimizar eventos de agregação e misfolding. Embora a LmMCA-Ia-C-term tenha sido expressa com sucesso, análises por SDS-PAGE e western blotting indicaram que a proteína recombinante foi direcionada para corpos de inclusão, permanecendo insolúvel após a lise bacteriana. Estratégias de otimização da expressão, incluindo variações de temperatura, tempo de indução, concentração de IPTG, pH e adição de glicose não resultaram em solubilização da enzima. Diante disso, discutimos abordagens de refolding in vitro a partir de proteínas insolúveis, bem como a utilização de sistemas eucarióticos alternativos, como Pichia pastoris, para favorecer o enovelamento adequado da proteína. Este estudo destaca os desafios na produção de proteínas recombinantes de protozoários e propõe caminhos alternativos para obtenção da LmMCA-Ia funcional.
Fontes alternativas de ácidos graxos no metabolismo lipídico e fisiologia do bijupirá (Rachycentron canadum)
(Universidade de Mogi das Cruzes, 2025-02-28) Costa, Sabrina Vitória Ferreira da; Araújo, Bruno Cavalheiro
Rachycentron canadum, conhecido no Brasil como bijupirá e internacionalmente como cobia, é um peixe marinho com alto potencial produtivo. No entanto, existem desafios em seu ciclo produtivo, , que ainda limitam sua produção em larga escala no Brasil, em especial na nutrição. O óleo de peixe (OP) é amplamente utilizado na nutrição de animais marinhos, devido aos seus ácidos graxos (AG) de cadeia longa e altamente insaturados da série ômega 3 (LC-PUFAs n-3). Porém, a produção de OP está em declínio, e ingredientes alternativos em dietas para a aquicultura, como por exemplo os óleos vegetais (OV) vêm sendo pesquisados nos últimos anos. Contudo, essa substituição pode impactar de forma negativa o crescimento de peixes marinhos, alterando o metabolismo lipídico, devido principalmente às quantidades elevadas de AGs saturados (SFA), monoinsaturados (MUFA) e polinsaturados de 18 carbonos da série ômega 6 (PUFA n-6), e inversamente à ausência de LC-PUFAs considerados essenciais para espécies marinhas, como o ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA) e o ácido araquidônico (ARA). Uma estratégia para minimizar os esses impactos é o uso de OVs suplementados com fontes ricas em LC-PUFAs. Com base no exposto, o objetivo desse trabalho foi testar diferentes níveis de inclusão do óleo de soja (OS) e de LC-PUFAs essenciais, como fonte lipídica alternativa em detrimento ao OP, em dietas para juvenis de bijupirá, e avaliar os efeitos desta substituição no desempenho produtivo, composição lipídica dos tecidos muscular e hepático, morfologia do tecido hepático e na expressão de genes relacionados às vias de síntese e oxidação de AGs do tecido hepático. Foi realizado um experimento nutricional de oito semanas utilizando quatro dietas isolipídicas, isoenergéticas e isoproteicas: OP (dieta controle, com 8,8% de OP como base lipídica), D1 (6% de OS), D2 (4,5% de OS) e D3 (3% de OS). As dietas experimentais (D1, D2 e D3) foram formuladas com a adição de 2% de óleo de coco (OC) e suplementadas com óleos ricos em ARA, EPA e DHA, cujos níveis aumentaram progressivamente entre os tratamentos. A inclusão de ARA foi de 0,1% na D1, 0,4% na D2 e 0,8% na D3, enquanto o EPA variou de 0,2% (D1) para 0,7% (D2) e 1,0% (D3). Já o DHA foi incorporado em 0,5% na D1, 1,2% na D2 e 2,0% na D3. Os resultados mostraram que o desempenho produtivo não foi afetado pelas diferentes dietas experimentais. Em comparação com os níveis dietéticos de AGs, os SFAs apresentaram um significativo menor percentual nos tecidos, enquanto MUFAs, PUFAs e LC-PUFAs tiveram deposição superior, exceto na dieta controle, onde PUFAs e LC-PUFAs foram menores. O percentual de LC-PUFAs no músculo acompanhou os níveis dietéticos, com exceção do ARA na dieta D3. Em especial o DHA teve seu maior nível de deposição na dieta D3, superando a dieta OP mesmo essa contendo os maiores percentuais deste AG. Essas observações à cerca do perfil de AGs sugere a ocorrência de um efeito poupador de AGs, devido a inclusão de SFAs, em especial o 12:0. A morfologia hepática revelou vacúolos lipídicos com maiores áreas em peixes alimentados com OP e D1, e vacúolos menores em D2 e D3. Por fim, a expressão dos genes relacionados ao metabolismo lipídico não apresentou alterações significativas entre os animais dos diferentes grupos experimentais. Conclui-se que o OS suplementado com LC-PUFAs essenciais pode substituir o OP em diferentes concentrações sem causar efeitos adversos na performance de crescimento e metabolismo lipídico de juvenis de bijupirá, e ainda, na dieta com maior nível de suplementação (D3) garantiu uma maior deposição de LC-PUFAs nos tecidos, em especial no muscular.