Pós-Graduação Stricto Sensu em Biotecnologia
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Item type:Item, Estudos de resíduos cruciais para a modulação de metacaspases de diferentes organismos(Universidade de Mogi das Cruzes, 2025-02-03) Trujilho, Mariana Nascimento Romero; Machado, Mauricio Ferreira MarcondesAs metacaspases são cisteíno-proteases da família C14, caracterizadas pela especificidade de clivagem pós-resíduos básicos e dependência de cálcio para ativação. Este estudo investigou a metacaspase tipo I de Saccharomyces cerevisiae (YCA1) e a metacaspase tipo II de Trypanosoma brucei (TbMCA2), destacando o papel de resíduos conservados na interação com cálcio e na regulação da atividade enzimática. Análises estruturais e funcionais identificaram a díade catalítica (Cys-His) e aspartatos críticos para a ligação ao cálcio. Experimentos de mutação sítio-dirigida demonstraram que o Asp283 é essencial para a estabilização e ativação da YCA1, enquanto mutações em Asp236, Asp252 e Asp253 impactaram marginalmente a função enzimática. A versão truncada YCA1-ΔN86 manteve atividade catalítica, sugerindo um mecanismo alternativo de ativação e diferenças na afinidade por cálcio mediadas pelo pró-domínio N-terminal. Adicionalmente, a triagem de compostos naturais revelou que quatro moléculas, incluindo derivados de chalcona e flavonoides, inibiram significativamente a TbMCA2, com três apresentando inibição competitiva e uma, inibição não competitiva. Estes achados reforçam a relevância dos resíduos de interação com cálcio na regulação das metacaspases e destacam novas perspectivas para o desenvolvimento de inibidores com potencial terapêutico contra a tripanossomíase humana africana. O estudo amplia a compreensão dos mecanismos moleculares de ativação e modulação das metacaspases, oferecendo subsídios para futuras aplicações biotecnológicas e farmacológicas.Item type:Item, Obtenção da metacaspase recombinante de Leishmania major(Universidade de Mogi das Cruzes, 2025-02-28) COSTA, João Pedro Martins Silva; MARCONDES, Maurício Ferreira MarcondesA Leishmania major é um protozoário parasita de elevada relevância clínica, sendo um grande problema de saúde pública. Devido a vários mecanismos de patogenicidade, fatores de virulência e aos mecanismos de resistência da L. major, além dos tratamentos atuais apresentarem limitações e potenciais efeitos adversos, é necessária a busca de novos alvos terapêuticos e novos tratamentos para infecções causadas por este agente infeccioso. A L. major apresenta uma única metacaspase (LmMCA-Ia), enzima envolvida na regulação de diversos mecanismos celulares e principalmente no processo de morte celular programada. Neste trabalho, buscamos clonar, expressar e purificar a LmMCA-Ia. No entanto, diversas tentativas de expressão da forma íntegra da proteína não resultaram na detecção da enzima. Como alternativa, foi produzida uma forma truncada da enzima, com deleção da região C terminal hidrofóbica (LmMCA-Ia-C-term), visando minimizar eventos de agregação e misfolding. Embora a LmMCA-Ia-C-term tenha sido expressa com sucesso, análises por SDS-PAGE e western blotting indicaram que a proteína recombinante foi direcionada para corpos de inclusão, permanecendo insolúvel após a lise bacteriana. Estratégias de otimização da expressão, incluindo variações de temperatura, tempo de indução, concentração de IPTG, pH e adição de glicose não resultaram em solubilização da enzima. Diante disso, discutimos abordagens de refolding in vitro a partir de proteínas insolúveis, bem como a utilização de sistemas eucarióticos alternativos, como Pichia pastoris, para favorecer o enovelamento adequado da proteína. Este estudo destaca os desafios na produção de proteínas recombinantes de protozoários e propõe caminhos alternativos para obtenção da LmMCA-Ia funcional.