Identificação de dois sítios catalíticos na metacaspase de Saccharomyces cerevisiae através de mutações sítio dirigidas
Loading...
Date
2023
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Universidade de Mogi das Cruzes
Abstract
As metacaspases são cisteíno-proteases pertencentes ao clã CD da família C14, e possuem características importantes, como a especificidade por clivagem após resíduos básicos (Arg/Lys), além de depender do íon cálcio para exercer sua atividade catalítica, ou seja, para estarem ativas, ao contrário do que se observa nas caspases que carecem do processo de dimerização para se tornarem ativas, já as metacaspases sofrem um autoprocessamento, primeiramente no N-terminal e posteriormente no C-terminal, tornando-se ativas. As metacaspases são definidas pela presença da subunidade grande (P20) e subunidade pequena (P10) e são classificadas em: tipos I, II e III. A metacaspase do tipo I possui como característica um pró-domínio no N-terminal da enzima, que antecede uma região rica em glutamina e asparagina. Na levedura Saccharomyces cerevisiae é encontrada uma metacaspase do tipo I, este organismo codifica uma única metacaspase, denominada como Yeast Caspase 1 (YCA1), que vem sendo exaustivamente estudada no processo de morte celular programada por apoptose. A apoptose foi descrita inicialmente em organismos multicelulares, no entanto hoje já se sabe que as células de levedura Saccharomyces cerevisiae exibem características apoptóticas semelhantes ao que ocorre em organismos pluricelulares. Como objetivo geral neste trabalho propomos obter por clonagem YCA1 recombinante, em sua forma íntegra e truncada, contendo mutações sítio dirigidas dos resíduos Cys155 e Cys276, e posteriormente expressar e purificar essas proteínas recombinantes. Os mutantes foram obtidos pela técnica de sobreposição de primers e clonagem pelo método T5 exonuclease DNA assembly (TEDA), usando como vetor de expressão o pET28(a)+. As proteínas foram expressas através da indução com isopropil-β-D-tiogalactosidase (IPTG) em sistema de E. coli BL21(DE3)pLysS e a purificação das amostras foi realizada em duas etapas, por cromatografia de afinidade em coluna de Ni-Sepharose e por cromatografia de exclusão molecular. A obtenção dos mutantes YCA1-C155A, YCA1-C276A, YCA1-C155/276A, tYCA1-C155A e tYCA1-C276A foi realizada com êxito, e foram confirmadas pela técnica de western blotting. Através das análises de SDS-PAGE dos mutantes íntegros, foi possível identificar que o resíduo Cys155, trata-se de uma cisteína catalítica importante para a etapa de autoprocessamento da YCA1, e que isso pode estar relacionado diretamente com a localização do N-terminal da enzima. Já a análise do SDS-PAGE dos mutantes truncados, trouxe uma perspectiva diferente sobre o processamento da YCA1, reforçando os dados obtidos no western blotting das formas truncadas, que levam a hipótese de um segundo processamento intermolecular entre as metacaspases já ativas, semelhante ao que ocorre entre as caspases para gerar sua forma ativa. Demonstramos também que os processamentos que levam a geração da forma ativa da enzima ocorrem no C-terminal da proteína diferentemente do que é descrito. Em conclusão, demonstramos a presença de uma segunda cisteína catalítica na estrutura da YCA1, bem como apresentamos uma nova teoria em torno da ativação desta enzima, demonstrando processamentos antes não descrito, sendo um autoprocessamento e um processamento intermolecular.
Description
Keywords
Saccharomyces cerevisiae, Cisteína Proteases, Mutação
Citation
DALZOTO, Laura de Azevedo Maffeis. Identificação de dois sítios catalíticos na metacaspase de Saccharomyces cerevisiae através de mutações sítio dirigidas. 2023. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2023.