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Item type:Item, Estudos de resíduos cruciais para a modulação de metacaspases de diferentes organismos(Universidade de Mogi das Cruzes, 2025-02-03) Trujilho, Mariana Nascimento Romero; Machado, Mauricio Ferreira MarcondesAs metacaspases são cisteíno-proteases da família C14, caracterizadas pela especificidade de clivagem pós-resíduos básicos e dependência de cálcio para ativação. Este estudo investigou a metacaspase tipo I de Saccharomyces cerevisiae (YCA1) e a metacaspase tipo II de Trypanosoma brucei (TbMCA2), destacando o papel de resíduos conservados na interação com cálcio e na regulação da atividade enzimática. Análises estruturais e funcionais identificaram a díade catalítica (Cys-His) e aspartatos críticos para a ligação ao cálcio. Experimentos de mutação sítio-dirigida demonstraram que o Asp283 é essencial para a estabilização e ativação da YCA1, enquanto mutações em Asp236, Asp252 e Asp253 impactaram marginalmente a função enzimática. A versão truncada YCA1-ΔN86 manteve atividade catalítica, sugerindo um mecanismo alternativo de ativação e diferenças na afinidade por cálcio mediadas pelo pró-domínio N-terminal. Adicionalmente, a triagem de compostos naturais revelou que quatro moléculas, incluindo derivados de chalcona e flavonoides, inibiram significativamente a TbMCA2, com três apresentando inibição competitiva e uma, inibição não competitiva. Estes achados reforçam a relevância dos resíduos de interação com cálcio na regulação das metacaspases e destacam novas perspectivas para o desenvolvimento de inibidores com potencial terapêutico contra a tripanossomíase humana africana. O estudo amplia a compreensão dos mecanismos moleculares de ativação e modulação das metacaspases, oferecendo subsídios para futuras aplicações biotecnológicas e farmacológicas.Item type:Item, Prospecção de moléculas como possíveis moduladores para a metacaspase-2 (tbMCA-IIa) de Trypanossoma brucei(Universidade de Mogi das Cruzes, 2024) Araujo, Laura HelenaAs metacaspases desempenham um papel importante na regulação da morte celular programada, especialmente em tripanossomatídeos como o Trypanosoma brucei, agente causador da Tripanossomíase Humana Africana (THA), doença esta que enfrenta desafios no tratamento devido à eficácia limitada e efeitos colaterais dos medicamentos existentes, tornando necessária a busca por novas moléculas terapêuticas eficazes e seguras. Estratégias inovadoras, como triagens fenotípicas para o desenvolvimento de inibidores seletivos, centrada nas proteases como alvos terapêuticos, também desempenham um papel relevante no progresso de tratamentos antitripanossoma. Nesse estudo foram testadas moléculas derivadas de compostos naturais para avaliar a capacidade de inibição da atividade da metacaspase-2 de Trypanosoma brucei, e também foi realizada a construção de um sistema celular de seleção de inibidores específicos para a TbMCA-IIa. Os resultados apontaram que as moléculas derivadas de éter de oxima (AO-7, AO-12 e EO-20) e compostos derivados de chalconas e flavonoides (EM-1A, EM-1B, EM-1C e EM-F12C) mostraram eficácia como inibidores, com destaque para AO-12, revelando-se não competitivo, e para os compostos EM-1A, EM-1B, EM-1C e EM-F12C, com valores de IC50 mais baixos e mecanismos de inibição competitivos e não-competitivos. Após a clonagem bem-sucedida do gene da TbMCA-IIa em um plasmídeo de baixa cópia, foram realizados testes utilizando CaCl2 para avaliar o crescimento celular, demonstrando que a expressão da metacaspase afetou significativamente o crescimento, enquanto que o clone em pET-28a(+) mostrou maior eficiência com 1 mM de CaCl2. Além disso, no experimento realizado com o gene da TbMCA-IIa em pET-28a(+) foi observado que a adição de glicose influenciou o crescimento celular. Esses testes validam a construção do sistema celular de seleção de inibidores, permitindo futuros testes com bibliotecas de inibidores.