Avaliação de resíduos chave para o funcionamento da metacaspase de candida albicans (CaMCA)
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Date
2024
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Universidade de Mogi das Cruzes
Abstract
As infecções fúngicas não só impactam a qualidade de vida dos pacientes, mas também representam um ônus substancial para os sistemas de saúde. Estratégias eficazes de prevenção e tratamento são essenciais para mitigar o impacto dessas infecções e proteger a saúde pública. O aumento nos casos de infecções por fungos do gênero Candida, especialmente Candida albicans, representa um desafio significativo para a saúde pública. Essas infecções, que podem variar de leves e superficiais a sistêmicas e potencialmente fatais, afetam uma ampla gama de pacientes, incluindo aqueles com sistemas imunológicos comprometidos. A transição da forma comensal de C. albicans para um patógeno é influenciada por uma série de fatores, incluindo condições ambientais e alterações na resposta imune do hospedeiro. As metacaspases, proteases estruturalmente relacionadas as caspases de mamíferos, têm ganhado destaque na pesquisa sobre a regulação da morte celular programada e na fisiologia celular. As caspases e metacaspases diferem em estrutura, ativação e função. Enquanto as caspases formam dímeros ativos e são altamente específicas para resíduos de aspartato, as metacaspases clivam seus substratos após um resíduo de arginina ou lisina na posição P1 e especialmente o tipo I, possuem um pró-domínio N-terminal que regula sua atividade catalítica. Embora compartilhem semelhanças estruturais, como a organização em folhas β e α-hélices, as metacaspases têm uma arquitetura distinta e dependem do íon cálcio para exercer a sua função catalítica. Presentes em organismos não metazoários, como plantas, fungos e protozoários, as como a CaMCA e YCA1, desempenham papéis multifuncionais na regulação de processos celulares, como apoptose, diferenciação celular e resposta ao estresse. Sua classificação em 3 tipos reflete sua diversidade funcional em diversos organismos, com estudos revelando funções desde a regulação do ciclo celular até a resposta a estímulos ambientais e patogênicos. A CaMCA e a YCA1 compartilham características estruturais semelhantes, incluindo resíduos críticos de cálcio e um N-terminal propenso a agregação. Para entender melhor o papel desses resíduos na função da CaMCA, construímos mutantes do sítio de cálcio e truncamos o N-terminal da CaMCA, semelhante ao que foi feito na YCA1, para investigar seu efeito na agregação e na função da proteína. A construção da CaMCA-Δ86 foi realizada utilizando a metodologia TEDA, enquanto os mutantes foram desenvolvidos através do TEDA em combinação com sobreposição de fragmentos e forma expressos em E. coli BL21(DE3)pLysS utilizando IPTG como indutor. Os produtos foram purificados utilizando resina de Niquel-sepharose e eluidos com imidazol. Para os dados de fluorescência intrínseca, foram utilizados o software Grafit 5 para análise e tratamento. A CaMCA selvagem passa por autoprocessamento, gerando fragmentos de ~55 e ~45 KDa, influenciado pelo cálcio, que também forma um fragmento adicional de ~30 KDa após 72 horas com 5 mM de CaCl2. A proteína tem alta afinidade (7 μM) e baixa afinidade (9,3 mM) pelo cálcio. A deleção no N-terminal (CaMCA-ΔN86) também apresenta autoprocessamento, gerando fragmentos de 43 e 33 KDa, com o cálcio desempenhando papel importante na ativação da enzima. A ausência do N-terminal altera a resposta ao cálcio, sugerindo que essa região regula o processo de clivagem. Mutantes como D252A ativam-se após 96 horas com cálcio, enquanto D268A, D299A e D268/269A não mostraram resposta. O mutante D268/299A revelou processamento com cálcio após 48 horas. Íons bivalentes, como bário e magnésio, ativaram a CaMCA de forma menos eficiente que o cálcio.
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SANTOS, Taíz dos Reis. Avaliação de resíduos chave para o funcionamento da metacaspase de candida albicans (CaMCA). 2024. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2024.