Obtenção da metacaspase recombinante de Leishmania major

Abstract

A Leishmania major é um protozoário parasita de elevada relevância clínica, sendo um grande problema de saúde pública. Devido a vários mecanismos de patogenicidade, fatores de virulência e aos mecanismos de resistência da L. major, além dos tratamentos atuais apresentarem limitações e potenciais efeitos adversos, é necessária a busca de novos alvos terapêuticos e novos tratamentos para infecções causadas por este agente infeccioso. A L. major apresenta uma única metacaspase (LmMCA-Ia), enzima envolvida na regulação de diversos mecanismos celulares e principalmente no processo de morte celular programada. Neste trabalho, buscamos clonar, expressar e purificar a LmMCA-Ia. No entanto, diversas tentativas de expressão da forma íntegra da proteína não resultaram na detecção da enzima. Como alternativa, foi produzida uma forma truncada da enzima, com deleção da região C terminal hidrofóbica (LmMCA-Ia-C-term), visando minimizar eventos de agregação e misfolding. Embora a LmMCA-Ia-C-term tenha sido expressa com sucesso, análises por SDS-PAGE e western blotting indicaram que a proteína recombinante foi direcionada para corpos de inclusão, permanecendo insolúvel após a lise bacteriana. Estratégias de otimização da expressão, incluindo variações de temperatura, tempo de indução, concentração de IPTG, pH e adição de glicose não resultaram em solubilização da enzima. Diante disso, discutimos abordagens de refolding in vitro a partir de proteínas insolúveis, bem como a utilização de sistemas eucarióticos alternativos, como Pichia pastoris, para favorecer o enovelamento adequado da proteína. Este estudo destaca os desafios na produção de proteínas recombinantes de protozoários e propõe caminhos alternativos para obtenção da LmMCA-Ia funcional.